img

در جستجوی ترکیبات ضد‌میکروبی و ژن‌های مقاومت به آنتی‌بیوتیک در متاژنوم خاک

در سال‌های اخیر باکتری‌های مقاوم و بیماری‌های عفونی از دلایل اصلی هزینه‌های درمانی کلان و مرگ و میر بوده‌است. علم متاژنومیکس چشم‌اندازی از منابع واجد ترکیبات ضد‌میکروبی و ژن‌های مقاومت به آنتی‌بیوتیک را در جمعیت‌های میکروبی موجود در محیط ارائه می‌دهد.

§         مقدمه

تا چندی پیش آنتی‌بیوتیک‌ها تنها برای درمان عفونت‌های انسانی کاربرد داشتند، اما هم‌اکنون کاربرد گسترده‌ی آن‌ها در کشاورزی، صنایع غذائی و دامپزشکی و همچنین مصرف بی‌رویه‌ی آن‌ها، سبب تأثیرات وسیع بر روی محیط‌های طبیعی و سلامتی انسان شده‌است. در دهه‌های اخیر میکروارگانیسم‌های کشت‌پذیر منبعی برای جداسازی و کلون ژن‌های مقاومت به آنتی‌بیوتیک و شناسائی ترکیبات ضد‌میکروبی محسوب می‌شد اما بیشتر تنوعات میکروبی به‌هنگام رشد آن‌ها در محیط‌های کشت آزمایشگاهی استاندارد، از‌دست می‌رفت.

 متاژنومیکس یک روش جایگزین برای نشان‌دادن ترکیبات ضد‌میکروبی و ژن‌های مقاومت به آنتی‌بیوتیک در جمعیت‌های میکروبی غیر‌کشت‌پذیر ساکن محیط محسوب می‌شود. این روش بر‌پایه‌ی تکنیک‌های مولکولی مانند استخراج، تکثیر و توالی‌یابی DNA نمونه‌های محیطی استوار است. این ایده که برای اولین بار توسط Handelsman و همکاران در سال 1998 پایه‌گذاری شد، به‌طورخلاصه شامل استخراج مستقیم و غیر‌مستقیم DNA از یک جمعیت میکروبی در محیط‌های طبیعی است که سبب ساخت کتابخانه‌ی متاژنومیکس می‌گردد. غربالگری بر‌اساس عملکرد ژن‌ها درکتابخانه‌ی متاژنومیکس یک روش اختصاصی برای شناسائی ژن‌های مقاومت به آنتی‌بیوتیک‌ها است. با توجه به اندازه‌ی قطعه‌ی وارد‌شده (insert) ، کتابخانه‌ی متاژنومیکس می‌تواند به انواع قطعات بزرگ (>40kb) و یا قطعات کوچک (<15kb) بسته به وزن مولکولی DNA تقسیم‌بندی شود.

در این‌جا بر روی نمونه‌های خاک به‌عنوان یک سیستم محیطی دینامیک و پیچیده که متشکل از آرکی‌ها، قارچها، ویروس‌ها و پروتزوا است، تمرکز می‌کنیم و سعی داریم تا روش‌های بهره‌گیری از متاژنومیکس برای بررسی گسترده‌ای در‌خصوص تنوع و فراوانی ژن‌های مقاومت و ترکیبات ضد‌میکروبی جدید موجود در جمعیت میکروبی خاک را معرفی کنیم.


 

§         ژن‌های مقاومت به آنتی‌بیوتیک درخاک

 به‌طور کلی مقاومت به آنتی‌بیوتیک‌ها می‌تواند از‌طریق انتقال افقی ژن (HGT)  و یا جهش خودبه‌خودی در ژن هدف ایجاد شود. گاهی ژن‌های مقاومت به آنتی‌بیوتیک می‌توانند با عناصر متحرک در ژنوم همراه شده و سبب انتقال ماده‌ی ژنتیکی به سایر باکتری‌ها از یک گونه به گونه‌ی دیگر شوند. همچنین ارتباط نزدیک میان انسان، حیوانات و محیط می‌تواند سبب تکامل و پراکنش ژن‌های مقاومت آنتی‌بیوتیکی شود. میکروارگانیسم‌های مقاوم در محیط‌های طبیعی مانند رسوبات دریایی عمیق، اکوسیستم‌های دست‌نخورده، خاک‌های مرطوب در عمق 2 تا 40 متری، زباله‌های شهری، آب‌های راکد و یا کیسه‌ی گوارشی بدن موجودات زنده وجود دارند. جمعیت میکروبی خاک شامل اعضای جنس‌های اشریشیا، کلبسیلا، سودوموناس و استرپتومایسز بوده که به بسیاری از دارو‌ها مقاومت نشان می‌دهند.

Risenfeld و همکاران در سال 2004 برای اولین بار اقدام به ساخت کتابخانه متاژنومیکس از خاک‌ جنگل‌های بلوط منطقه‌ی ویسکانسین (آمریکای شمالی) کردند که نشان می‌داد از میان چندین گیگاباز DNA کلون شده، 9 قطعه کلون‌شده نسبت به آنتی‌بیوتیک‌های آمینوگلیکوزاید و تتراسایکلین مقاومت نشان می‌دادند. پژوهش مشابهی در خاک‌های دست‌نخورده‌ی آلاسکا برای یافتن ژن‌های مقاومت به β-Lactam نیز انجام شد. نتایج آن‌ها نشان داد که بتالاکتاماز جداشده از خاک‌های آلاسکا با انواع جداسازی‌شده از محیط‌های کلینیکی متفاوت هستند.

نمونه‌ی دیگر از شناسائی ژن‌های مقاومت در محیط خاک توسط Torres-Cortes و همکاران در سال 2011 انجام شد، نتایج آن‌ها حاکی از مقاومت تعداد زیادی از کلون‌ها بود. در این بین یکی ازکلون‌های غربال‌شده، ژن دی‌هیدروفولات ردوکتاز را بیان می‌کرد که آنزیم Tm8-3 را کد می‌کند. این ژن مربوط به مقاومت به آنتی‌بیوتیک‌های سنتتیک مانند Trimethoprim بود. اگرچه مدارک دقیقی از شارش ژن‌های مقاومت از محیط خاک به محیط‌های کلینیکی و بر‌عکس وجود ندارد، اما مطالعات انجام‌شده توسط Forsberg و همکاران در سال 2012 نشان داد که ژن‌های مقاومت دارای تشابه نوکلئوتیدی 100% با انواع ژن‌های تشخیص‌داده‌شده در نمونه‌های کلینیکی بیماری‌زا هستند که نشان‌دهنده اشتراک این گروه از ژن‌ها در میان این دو طیف از باکتری‌ها است. اکثر این باکتری‌ها نسبت به آنتی‌بیوتیک‌هائی از جمله باکتریوسین‌ها، بتالاکتام‌ها، ونکومایسین، کلرامفنیکل و تتراسایکلین مقاومت نشان می‌دادند.

غربالگری عملکردی کتابخانه متاژنومیکس می‌تواند راهکاری سریع برای شناسائی کلون‌ها با اهداف مشخص باشد، اگرچه نیاز به بیان عملکرد موردنظر در سلول میزبان وجود دارد و به همین دلیل تعداد کلون‌های فعال کاهش می‌یابد. علی‌رغم فراوانی پایین کلون‌های مثبت، تنها کلون یافت‌شده از کتابخانه متاژنومیکس از نمونه‌های جداشده از تالاب‌های کره جنوبی، در E. coli بیان شده و بررسی توالی آمینواسیدی(Est U1) نشان‌دهنده موتیف حفاظت‌شده S-X-X-K  بود که مربوط به خانواده‌ی کربوکسی استراز‌های VIII است. آنزیم Est U1 با ویژگی کاتالیتیکی می‌تواند در حلقه بتالاکتام آنتی‌بیوتیک‌ها ایجاد برش کند.

 

§         چشم‌اندازی از نسل جدید توالی‌یابی[1] و تکثیر[2] ژن‌های مقاومت آنتی‌بیوتیکی

با توجه به هزینه‌های تکنولوژی ‌توالی‌یابی، محققین در تلاش‌اند متغیر‌هائی برای آنالیز این حجم از داده‌های در‌دسترس کشف‌کنند. پس از توالی‌یابی کل متاژنوم، کنارهم قرار گیری [3](مونتاژ)، یک مرحله‌ی حیاتی محسوب می‌شود، زیرا محققین با تعداد زیادی توالی مجزای ناشناخته سر و کار دارند. به‌منظور به‌حداقل‌رساندن تأثیر توالی‌های کایمریک، محققان بیوانفورماتیک تلاش کردند تا الگوریتم مونتاژ جدیدی خلق نمایند. Metavelvet مثالی از یک نرم‌افزار مونتاژ‌کننده است. بهره‌گیری از این فناوری می‌تواند سبب تولید قالب‌های خواندن[4] بلندتری شده و پیش‌بینی ژن‌ها را تسهیل نماید.

اخیرأ ابزار‌های قدرتمندی برای آنالیز توالی‌ها اجرا می‌شود که درمیان آن‌ها می‌توان به MOCAT و MetAMOS اشاره کرد. از این الگوریتم‌ها می‌توان برای پردازش، مونتاژ و پیش‌بینی ژن در توالی متاژنومیک استفاده نمود. این ابزار قادر است امکان تفسیر عملکردی ORF‌ها با استفاده از BLAST را فراهم کرده و بدین ترتیب ORF‌ها را تفسیر و شرح نماید.

شناسائی دقیق ژن‌های پیش‌بینی‌شده، مهمترین مرحله در‌جهت شناسائی پپتید‌های ضد‌میکروبی جدید و ژن‌های مقاومت آنتی‌بیوتیکی است. برای دستیابی به این هدف نیاز به یک پایگاه داده‌ی مرجع وجود دارد. توالی‌های ژنی می‌توانند از پایگاه‌های داده مانند NCBI Ref Seq و یا پایگاه داده‌ی ژن‌های مقاومت آنتی‌بیوتیکی[5] (ARDB) بازیابی شوند، هرژن حداقل با یکی از 249 آنتی‌بیوتیک توصیف‌شده در ARDB که با 1737گونه مرتبط است، ارتباط می‌یابد. پایگاه‌های داده علاوه بر شناسائی ژن‌های مقاومت، در شناسائی نوکلئوتید‌ها و واریانت‌های آمینواسیدی توالی‌ها نقش مهمی دارد.

در شناسائی ژن‌های کدکننده پپتید‌های ضدمیکروبی علاوه بر جست‌وجوی تشابه توالی در پایگاه داده‌ی مرجع به‌منظور یافتن پپتید‌های جدید، یک پایگاه داده‌ی ثانویه که حاوی پپتید‌ها با فعالیت ضد‌میکروبی می‌باشد، نیز کاربرد دارد. مثالی از این پایگاه داده APD2 می‌باشد که پپتید‌های ضد‌میکروبی مشخص‌شده را بر‌اساس خانواده، منبع و هدف تأثیر آن‌ها سازماندهی‌کرده‌است. این پایگاه شامل بیش از 2400 ترکیب شناخته ‌شده می‌باشد. 1986 مورد دارای خاصیت ضد‌میکروبی، 890 مورد ضد‌قارچی و 148 مورد ضد‌ ویروسی اند. AMPPred مثالی از یک نرم‌افزار است که با استفاده از 5 ویژگی، فعالیت ضد‌میکروبی توالی‌های جدید ترجمه‌یافته را پیش‌بینی می‌کند.

 

§         ترکیبات ضد‌میکروبی خاک

متاژنومیکس علاوه بر شناسائی ژن‌های مقاومت به آنتی‌بیوتیک‌ها، توانائی شناسائی مولکول‌های کوچک مختلف با فعالیت ضد‌میکروبی را نیز فراهم می‌کند. ترکیبات ضد‌میکروبی دارای منشأ گیاهی، حیوانی و میکروارگانیسمی هستند. به‌نظر می‌رسد در میان آن‌ها جوامع میکروبی کارآمدترین منبع برای آنتی‌بیوتیک‌ها باشند. خاک منبع مهمی از محصولات فعال زیستی با خاصیت ضد‌عفونت است. برای انتخاب و جداسازی این ترکیبات تکنیک‌های متعددی از جمله ساخت کتابخانه‌ی متاژنومیک، بیان ترکیبی، توالی‌یابی جمعیت میکروبی خاک و روش‌های تک‌سلولی به‌کار گرفته می‌شود. به‌طور معمول برای تهیه کتابخانه میزبان مناسب E.coli است. پس از ساخت کتابخانه، مرحله‌ی بعدی شامل شناسائی کلون توسط ژن‌های همسایه insert می‌باشد و سپس غربالگری آن‌ها بر‌اساس رنگ، تغییرات ظاهری و تشکیل هاله عدم رشد انجام می‌شود.

روش دیگر برای غربالگری فنوتیپ می‌تواند بر‌پایه‌‌ی تعیین توالی DNA باشد. این روش به‌طور موفقیت‌آمیزی برای تشخیص مولکول‌های چند‌بخشی پلی‌کتاید سنتاز (PKS) و پپتید سنتتاز‌های غیر ریبوزومی (NRPS) مورد استفاده قرار گرفته‌است. پژوهش‌های تک‌سلولی نیز روشی قوی برای کشف باکتری‌های محیطی محسوب می‌شود، یکی از فواید این روش آن است که ژن‌ها می‌توانند با توجه به اطلاعات تاکسونومیک خود جمع‌آوری شوند و اجتماع یابند. این باعث تشخیص تاکسون‌های مولد (تولید‌کننده) برای انتخاب میزبان بیانی، برای ژن‌های کلون‌یافته مناسب می‌شود.

 یکی از آنتی‌بیوتیک‌های غربال‌شده پلی‌کتاید‌ها هستند که ترکیبات طبیعی حاوی چندین گروه عملکردی β-هیدروکسی کتون و یا β-هیدروکسی آلدئید می‌باشند. این متابولیت‌های طبیعی دارای عملکرد‌های مختلف ضد‌کلسترولی، ضد‌سرطانی، ضد‌میکروبی، ایمنی‌زائی و آنتی‌بیوتیکی هستند. شرکت‌های داروئی با بهره‌گیری از پلی‌کتاید‌ها توانسته‌اند آنتی‌بیوتیک‌هائی مانند Geldanamycin، Doxycycline،  Azithromycin و Erythromycin تولید کنند.

با تلفیق PCR و ابزار‌های بیوانفورماتیکی متعدد مانند AntiSMASH (پوشش آنالیز آنتی‌بیوتیک‌ها و متابولیت‌های ثانویه) محققین توانستند خوشه‌های ژنی کد‌کننده‌ی مسیر‌های بیوسنتزی تولید‌کننده فراورده‌های طبیعی با کارکرد‌های درمانی را در باکتری‌ها کشف کنند. طی این تحقیقات ترکیبات آنتی‌بیوتیکی مانند ترکیبات شبه teicoplanin ، شبه azinomycin، شبه friumilicin  و شبه rapamycin و ترکیباتی با فعالیت ضد‌توموری مانند فراورده‌های شبهthiocoraline  و tallysomycin به‌دست آمده‌اند. جداسازی DNA از نمونه‌های خاک نواحی بیابانی Anza-Borrego در کالیفرنیا سبب یافتن خوشه‌ی ژنی بیوسنتز‌کننده Borregomycin شده است. این ترکیب از مسیر متابولیکی بیوسنتز‌کننده تریپتوفان‌دایمر به‌دست می‌آید که یکی از شاخه‌های آن تولیدA  Borregomycin با خاصیت ضد‌انعقادی و مهار‌کنندگی کینازی و شاخه‌ی دیگر این مسیر تولید Borregomycin B-D با فعالیت ضد‌سرطانی و ضدباکتریایی می‌کند. علاوه براین با کلون خوشه ژنی Bor R در Streptomyces albus آنتی‌بیوتیک Borregomycin به تولید انبوه رسیده‌است.

در پژوهشی دیگر واریانت مفیدی از Plantaricin از متاژنوم خاک جداسازی شده و با استفاده از پرایمر‌های مخصوص این ژن و PCR، ژن‌های pln E,F,G,H انتخاب و جداسازی شده‌اند. پلانتاریسین‌ یک پپتید کاتیونیک متعلق به خانواده باکتریوسین‌ها است که علیه اهداف پاتوژنیک عمل می‌کند. تولید پپتید‌های نوترکیب پلانتاریسین‌ها توسط  & Srivastava Pal در سال 2014 نشان داد که این باکتریوسین نوترکیب دارای گستره فعالیت ضد‌میکروبی وسیعی علیه بسیاری از باکتری‌های بیماری‌زا است. پلانتاریسین‌ها می‌توانند با برقراری ارتباط با لایه‌های لیپیدی غشای باکتری‌های گرم مثبت، گرم‌منفی، سلول‌های قارچی و حتی توموری، آن‌ها را شدیدأ تحت کنترل خود بگیرند. علاوه‌بر‌این از‌طریق کشت گونه‌های قابل کشت Lactobacillus plantarum می‌توان پلانتاریسین را به‌میزان قابل‌توجهی تولید و در تحقیقات بیوتکنولوژی پزشکی به‌کار گرفت.

به‌نظر می‌رسد فناوری متاژنومیکس گام مهمی در ‌جهت استخراج ترکیبات ضد‌میکروبی جدید ‌علیه باکتری‌های مقاوم برداشته‌است و امکان تولید میکروارگانیسم‌های دارای توانائی ترشح این ترکیبات در مقیاس بالا و با هزینه‌ی کم را به‌جای تولید شیمیائی آنتی‌بیوتیک‌ها فراهم و تا حد زیادی به کنترل عفونت و مقاومت‌های آنتی‌بیوتیکی خطرناک کمک کرده‌است.




administrator

درباره شیرین شادبخت

من یک نویسنده در بیومگ هستم

مجموع نظرات این خبر : 0 نظر

درج نظر